การตรวจหาและวิเคราะห์เชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (SARS-CoV-2) ในน้ำเสียหลังการระบาด สามารถให้ข้อมูลสนับสนุนที่สำคัญสำหรับการตรวจทางการแพทย์ รวมถึงการให้สัญญาณเตือนภัยล่วงหน้าของการระบาด การติดตามการพัฒนาของการระบาดในชุมชน และการระบุผู้ป่วยที่ไม่แสดงอาการในชุมชน

RNA ของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในตัวอย่างน้ำเสียจะเจือจางอย่างมากเนื่องจากอิทธิพลของประชากรในชุมชน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการเพิ่มความเข้มข้นของไวรัสก่อนทำการทดสอบ บทความนี้ประเมินผลกระทบของกระบวนการทางระเบียบวิธีที่แตกต่างกัน 11 วิธีต่อประสิทธิภาพของการตรวจหาไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในน้ำเสีย รวมถึงการเปรียบเทียบวิธีการปริมาณน้อยแปดวิธี การเปรียบเทียบวิธีการปริมาณมากกับปริมาณน้อย และการเปรียบเทียบวิธีการสกัดที่แตกต่างกันสองวิธี

图文摘要 | Graphical abstract

บทนำ

การตรวจหาและวิเคราะห์เชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (SARS-CoV-2) ในน้ำเสียหลังการระบาด สามารถให้ข้อมูลสนับสนุนที่สำคัญสำหรับการตรวจทางการแพทย์ รวมถึงการให้สัญญาณเตือนภัยล่วงหน้าของการระบาด การติดตามการพัฒนาของการระบาดในชุมชน และการระบุผู้ป่วยที่ไม่แสดงอาการในชุมชน RNA ของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในตัวอย่างน้ำเสียจะเจือจางอย่างมากเนื่องจากอิทธิพลของประชากรในชุมชน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการเพิ่มความเข้มข้นของไวรัสก่อนทำการทดสอบ บทความนี้ประเมินผลกระทบของกระบวนการทางระเบียบวิธีที่แตกต่างกัน 11 วิธีต่อประสิทธิภาพของการตรวจหาไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในน้ำเสีย รวมถึงการเปรียบเทียบวิธีการปริมาณน้อยแปดวิธี การเปรียบเทียบวิธีการปริมาณมากกับปริมาณน้อย และการเปรียบเทียบวิธีการสกัดที่แตกต่างกันสองวิธี

การเปรียบเทียบวิธีการเพิ่มความเข้มข้นแปดวิธีโดยใช้ปริมาตรเริ่มต้นขนาดเล็ก

ตัวอย่างน้ำทิ้งที่เก็บรวบรวมถูกทำให้หมดฤทธิ์ จากนั้นจึงเติมเชื้อไวรัส SARS-CoV-2 ที่ถูกทำให้หมดฤทธิ์แล้วเพื่อประเมินวิธีการ สำหรับตัวอย่างปริมาณน้อย มีการประเมินกระบวนการทางระเบียบวิธีแปดวิธีโดยอิงตามหลักการทางระเบียบวิธีที่แตกต่างกันสี่ประการ พบว่าวิธี ultracentrifugation แสดงการกู้คืนสูงสุด (25.4 ± 5.9%) และสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.01) เมื่อเทียบกับหลักการวิธีอื่น ๆ ตามด้วยการตกตะกอนและการกรองแบบเหวี่ยงหนี และสุดท้ายคือการดูดซับเมมเบรน-ชะล้าง (รูปที่ 1)

รูปที่ 1 การเปรียบเทียบวิธีการปริมาณน้อยแปดวิธี

(a) ค่า Ct (b) การกู้คืน UC: Ultracentrifugation (150,000 × g, 60 นาที); AlCl3: AlCl3 flocculation and precipitation (1%, 0.3 M, v/v); PEG: PEG precipitation (10% PEG, w/v, and 2% NaCl, w/v); MgCl2: MgCl2 precipitation (1%, 2.5 M, v/v). A15: Centrifugal ultrafiltration (using Amicon-Ultra 15 Centrifugal Filter with 10 kDa molecular equivalent); C70: Centrifugal ultrafiltration (using Centricon Plus-70 Centrifugal Filter with 30 kDa molecular equivalent); AlM: Membrane adsorption-elution (0.45% NaCl, w/v, and 2% NaCl, w/v); MgCl2: MgCl2 precipitation (1%, 2.5 M, v/v); AlM: Membrane adsorption-elution (0.45% NaCl after adding AlM: Membrane adsorption-elution (0.45 μm negatively charged filter membrane after addition of AlCl3 for adsorption-elution); MgM: Membrane adsorption-elution (0.45 μm negatively charged filter membrane after addition of MgCl2 for adsorption-elution).

การเปรียบเทียบวิธีการเพิ่มความเข้มข้นของปริมาณมากและปริมาณน้อย

เพื่อสำรวจความเป็นไปได้ในการใช้ปริมาณน้ำทิ้งที่มากขึ้น (1,000 มล.) เพื่อปรับปรุงความไวของวิธี จึงมีการเปรียบเทียบวิธีการปริมาณมากสามวิธีกับวิธีปริมาณน้อยที่เหมาะสมที่สุด (ultracentrifugation) ในตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV-2 แม้ว่าความไวของวิธี ultracentrifugation ปริมาณมากจะดีกว่าวิธีปริมาณมากอื่น ๆ อีกสองวิธี (การตกตะกอน AlCl3 และการดูดซับเมมเบรน) แต่ก็มีความไวใกล้เคียงกับวิธี ultracentrifugation ปริมาณน้อยเท่านั้น ในตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV-2 และที่ความเข้มข้นระดับต่ำ ทั้งวิธีปริมาณมากและปริมาณน้อยให้ช่วงการตรวจจับเดียวกัน ในตัวอย่างน้ำทิ้งจริง 35 ตัวอย่างที่ไม่ได้เติม SARS-CoV-2 วิธี ultracentrifugation ปริมาณมากและปริมาณน้อยแสดงอัตราการตรวจจับเดียวกัน โดยวิธีปริมาณมากมีค่า Ct ต่ำกว่าเล็กน้อย (0.67 Ct) กว่าวิธีปริมาณน้อย ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าการเพิ่มปริมาณน้ำทิ้งไม่ได้ปรับปรุงความไวของวิธีอย่างมีนัยสำคัญ อาจเนื่องมาจากผลกระทบของเมทริกซ์ของน้ำทิ้งที่ถูกทำให้เข้มข้นพร้อมกันในวิธีปริมาณมาก ซึ่งไม่เอื้อต่อการสกัดและการตรวจหา RNA ในภายหลัง

รูปที่ 2 การเปรียบเทียบวิธีการปริมาณมากและปริมาณน้อย

(a) การเปรียบเทียบค่า Ct ระหว่างวิธีการปริมาณมากสามวิธีและวิธีการปริมาณน้อยที่เหมาะสมที่สุด (b) การเปรียบเทียบค่า Ct ระหว่างวิธีการ ultracentrifugation ปริมาณมากและปริมาณน้อยโดยอิงจากตัวอย่างน้ำเสียจริงที่ไม่ติดฉลาก 35 ตัวอย่าง

Large-UC: large-volume ultracentrifugation (20,000 × g for 30 min, then 150,000 × g for 60 min); AlCl3: AlCl3 flocculation and precipitation (1%, 0.3 M, v/v); Membrane: membrane adsorption-elution (adsorption-desorption using a negatively-charged 0.45 μm membrane); Small-UC: small-volume ultracentrifugation (150,000 × g for 60 min). UC: small volume ultracentrifugation (150,000 × g ultracentrifugation for 60 min).

ตารางที่ 1 อัตราการตรวจจับและค่า Ct สำหรับตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV-2 ที่ความเข้มข้นวิกฤต และสำหรับตัวอย่างน้ำทิ้งจริงที่ไม่ได้เติม

การเปรียบเทียบวิธีการสกัดสองวิธี

ใช้วิธี ultracentrifugation ปริมาณน้อยเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของตัวอย่างน้ำทิ้งโดยเปรียบเทียบวิธีการสกัด RNA ที่แตกต่างกันสองวิธี ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่า QIAamp Viral RNA Kit (Viral Kit) สามารถตรวจจับค่า Ct ที่ต่ำกว่า TRIzol Plus RNA Purification Kit (TRIzol Kit) ในตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV-2 เพื่อให้เกิดผลกระทบของเมทริกซ์ที่แตกต่างกัน (รูปที่ 3a) และ QIAamp Viral RNA Kit (Viral Kit) สามารถตรวจจับช่วงความเข้มข้นได้ถึงตัวอย่างความเข้มข้นต่ำในตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV -2 และที่ความเข้มข้นวิกฤตในตัวอย่างน้ำทิ้ง Viral Kit สามารถตรวจจับช่วงความเข้มข้นได้ถึงตัวอย่างความเข้มข้นต่ำ ในขณะที่ TRIzol Kit สามารถตรวจจับได้เฉพาะตัวอย่างความเข้มข้นปานกลางเท่านั้น (ตารางที่ 1 รูปที่ 3b) ในตัวอย่างที่เจือจางใน PBS (น้ำเกลือ) หรือความชันของน้ำทิ้ง Viral Kit แสดงประสิทธิภาพการสกัดที่สูงกว่า TRIzol Kit (รูปที่ 3c และรูปที่ 3d) ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่า Viral Kit ทำงานได้ดีกว่า TRIzol Kit แต่ทั้งสองให้ผลการสกัดที่ดีกว่า

รูปที่ 3 การเปรียบเทียบวิธีการสกัดทั้งสอง

(a) การเปรียบเทียบค่า Ct ของตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV-2 เพื่อให้เกิดผลกระทบของเมทริกซ์ที่แตกต่างกัน (b) การเปรียบเทียบค่า Ct โดยอิงจากตัวอย่างจริงที่ไม่เติม 31 ตัวอย่าง (c) การเปรียบเทียบค่า Ct ของตัวอย่างที่เติมด้วยการเจือจางแบบไล่ระดับด้วย PBS และ (d) การเปรียบเทียบค่า Ct ของตัวอย่างที่เติมด้วยการเจือจางแบบไล่ระดับด้วยน้ำทิ้ง

สรุป

ในบทความนี้ มีการประเมินวิธีการตรวจหาไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ที่แตกต่างกัน 11 วิธี ซึ่งรวมถึงหลักการของวิธีที่แตกต่างกัน ปริมาณน้ำทิ้งที่แตกต่างกัน และวิธีการสกัดที่แตกต่างกัน โดยใช้ทั้งตัวอย่างน้ำทิ้งที่เติม SARS-CoV-2 และตัวอย่างน้ำทิ้งจริงที่ไม่เติม โดยรวมแล้ว วิธี ultracentrifugation ปริมาณน้อยรวมกับ Viral Kit สำหรับการสกัด RNA โดยวิธี virus lysate ช่วยให้สามารถตรวจหาไวรัส SARS-CoV-2 ในน้ำเสียได้อย่างรวดเร็วและมีความไวสูง ผลการศึกษาครั้งนี้ให้การสนับสนุนข้อมูลและอ้างอิงสำหรับการประยุกต์ใช้วิธีการที่มีอยู่หรือพัฒนาขึ้นใหม่สำหรับการตรวจหา SARS-CoV-2 ในน้ำทิ้ง